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    公开号:WO1990012884A1
    申请号:PCT/JP1990/000538
    申请日:1990-04-25
    公开日:1990-11-01
    发明作者:Gilb Soe；Isao Kohno；Michiyo Tanaka
    申请人:Iatron Laboratories, Inc.；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 c反応性蛋白質に対するモノ クローナル抗体 技術分野
    [0002] この発明は、 C反応性蛋白質と特異的に反応する新規モノ ク 口一ナル抗体、 そのモノ ク口一ナル抗体を分泌するハイ ブ リ ドーマ細胞、 およびそのモノ クローナル抗体を用いる免疫 定量法に関する。 背景技術
    [0003] C反応性蛋白質 （略称 CRP)は急性期蛋白質の一種であって、 組織破壊を伴うような炎症性疾患等の際には血中濃度が急増 するが、 正常人血中には微量 （ 1 Zm£以下） しか認められ ないので、 各種の化膿症やリ ゥマチ性疾患等の診断に広く利 用されている。 この C R Pは、 第 1図に示すように、 5つの 円盤状サブユニッ ト （分子量約 21, 000) からなる 5量体であ り、 C R Pに対するモノ ク口ーナル抗体としては既に 2種類 のものが作製されている（T he Jour na l o f I mmuno l ogy, vo l 131， 2411- 2415) 。 すなわち、 円盤状サブュニッ トの円形上 面 （第 1図の A面 ： 以下単に A面と称することがある） には 特異的に反応するが円盤状サブュニッ トの円形底面 （第 1 図 の B面 ： 以下単に B面と称することがある） には反応しない モノ ク ローナル抗体、 及び円盤状サブュニッ トの円形底面 ( B面） には特異的に反応するが円盤状サブュニッ トの円形 上面 （A面） とは反応しないモノ ク ロ ーナル抗体である。 し かしながら、 前者のモノ ク口一ナル抗体又は後者のモノ ク口 ーナル抗体のいずれか一方を不溶性担体に結合させてから C R P含有試料と混合しても凝集反応を起こさない。 従って、 上記の公知モノ ク口ーナル抗体を用いて C R Ρを定量する場 合には、 両方のモノ ク口ーナル抗体を利用したサ ン ドィ ツチ 了ッセィ等を用いることが必要であった。 発明の開示
    [0004] 本発明者は、 1種類のモノ ク ローナル抗体だけを用いて C R Ρと凝集反応を起こさせることを目標にして研究を行つ. たところ、 従来公知のモノ クロ ーナル抗体とは別異の部位で C R Ρの円盤状サブュニッ トと特異的に反応する新規モノ ク π—ナル抗体を見出した。
    [0005] 従って、 本発明は、 C反応性蛋白質（CRP) の側面に特異的 に反応するモノ ク ローナル抗体、 すなわち、 C反応性蛋白質 (CRP) において円盤状サブュニッ トの側面 （第 1図の C面 ： 以下単に C面と称することがある） に特異的に反応するモノ ク口ーナル抗体を提供するものである。
    [0006] 本発明はさらに、 不溶性担体に固定させることにより、 C 反応性蛋白質（CRP) との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応 を起すことのできるモノ ク ロ ーナル抗体を提供する。
    [0007] 更に本発明は、 C反応性蛋白質（CRP) で免疫したマウスの 脾臓細胞とマウスのミ エローマ細胞との融合によつて形成さ れ、 C反応性蛋白質（CRP) の側面に特異性に反応するモノ ク ロ ーナル抗体を分泌することを特徴とする、 ハイブリ ドーマ 細胞にも関する。
    [0008] 更に本発明は C反応性蛋白質（CRP) の側面に特異的に反応 するモノ ク ロ一ナル抗体を用いることを特徵とする、 血漿中 の C反応性蛋白質（CRP) の免疫定量法にも関する。 図面の簡単な説明
    [0009] 第 1図は C反応性蛋白質（CRP) の構造を模式的に示す説明 図である。
    [0010] 第 2図は凝集反応速度と C R P濃度との関係を示すグラフ である。 発明を実施するための最良の形態
    [0011] C R Pに対するモノ クロ一ナル抗体である本発明による抗 C R Pモノ ク ローナル抗体は、 新規なマウス · ノヽイ ブリ ドー マ細胞をィ ン ♦ ビトロ （例えば培地中） またはイ ン . ビボ
    [0012] (例えばマウスの腹腔内） で培養することによって製造する ことができる。
    [0013] ここで用いるマウス ·ハイブリ ドーマ細胞は、 一般的には C R Pで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミ エローマ細 胞 （骨髄腫細胞） とを、 Koh l erおよび M i l ste i nの方法 [Natu re 第 256巻 495頁 （1975年） 参照] により細胞融合して製造す ることが可能である。
    [0014] また、 上記のハイプリ ドーマ細胞を培養する培地としては、 ハイプリ ドーマ細胞の培養に適した任意の培地を用いること ができ、 好適にはダルべッ コ氏変法ィ一グル氏培地（Dulbecco' s modified Eeagle' s medium； 以下 DME と記す。 ） にゥ シ胎児 血清、 L一グルタ ミ ン、 L一ピルビン酸および抗生物質 （ぺ ニシリ ン Gとス ト レブトマイ シン） を含む培地が用いられる。 上記のハイブリ ドーマ細胞の培養は、 イ ン · ビ ト ロの場合 には例えば培地中で 5 %C02 濃度および 37でで約 3 日間、 ま たィ ン · ビボ例えばマウスの腹腔内で培養する場合には約 14 日間実施する。
    [0015] このようにして製造された培養液またはマウスの腹水から モノ ク π—ナル抗体を分離、 精製する場合には、 蛋白質の単 離、 精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能であ る。 そのような方法としては、 硫安塩析、 イ オ ン交換クロマ トグラフィ一、 分子篩ゲルを用いる分子篩力ラムクロマ トグ ラ フィ ー、 プロテイ ン A結合多糖類を用いる親和性カ ラムク 口マ トグラフィ一、 透析、 凍結乾燥の方法等がある。
    [0016] このようにして得られた抗 C R Pモノ ク ϋーナル抗体は、 他の血漿蛋白とは反応しないで、 C R Ρとだけ特異的に結合 する能力を有する。 しかも、 この発明による抗 C R Ρモノ ク σ—ナル抗体は円盤状サブュニッ トの円形上面 （八面） 又は 円形底面 （Β面） とは反応せず、 側面 （C面） とのみ特異的 に反応する。 更に、 この抗 C R Pモノ クロ一ナル抗体は、 こ れを不溶性担体に固定させると、 C R Pとの間で凝集反応を 起こすことができるので、 C R Ρの免疫定量用試薬として有 用である。 例えば、 凝集反応による C R Ρ定量法はこの発明 による抗 C R Ρモノ ク ローナル抗体 1種類のみを用い、 これ を公知の化学結合法 （架橋剤としてカルボジィ ミ ド、 グルタ ルアルデヒ ド等を用いる） 又は物理吸着法によって、 通常用 いる不溶性担体 〔例えばラ テ ッ ク ス （例えばポ リ スチ レンラ テッ クス粒子） 〕 に結合させて複合体を形成する。 この抗
    [0017] C R Pモノ クロ ーナル抗体結合不溶性担体複合体の既知一定 量と未知量の C R Pを舍有する水性試料 （例えば血清、 血漿、 尿） の一定量とを、 適当な反応容器例えばスライ ド板上ある いは反応セル中で接触させる。 こう して形成される凝集の程 度から C R P濃度の定量を行う ことができる。 例えばスライ ド板の場合には目視的に、 反応セルの場合は特定の波長を用 いて分光学的に凝集反応を測定し、 被検試料中の C R P濃度 を定量することができる。
    [0018] また、 この発明の抗 C R Pモノ ク ローナル抗体と別異の抗 C R Pモノ クローナル抗体 （例えば円盤上サブュニッ ト の円 形上面又は円形底面と特異的に反応するモノ ク口ーナル抗体） とを用いて各種の C R P含有水性試料の免疫定量法を実施す ることができる。 実施例 - 次に、 この発明を実施例により更に詳細に説明するが、 こ の発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
    [0019] 実施例 1
    [0020] ( a ) 免疫化した脾臓細胞の調製 ：
    [0021] C R F免疫原溶液 〔ペルフ リ ーズ社 （米国） 〕 （A280nm= 0. 1 ) を等量のフ ロ イ ンド氏完全アジュバン トと乳化するま で混合し、 その混合液 200 ^をマウス腹腔内に投与すること により免疫を行なった （第 1回免疫） 。 30日経過後、 該マウ スに上記と同様の混合液 200 /^をマウス腹腔内に投与した
    [0022] (第 2回免疫） 。 第 2回免疫から 21日経過後、 C R P免疫原 溶液（A280nm=0. 1 ) を等量の生理食塩水で希釈し、 その希釈 液 200^を、 該マウスの静脈内に投与した （最終免疫） 。 最 終免疫から 3 曰経過後、 脾臓を無菌的にマウスから取り出し、 次の細胞融合工程に使用した。
    [0023] ( b ) 細胞融合 ：
    [0024] 無菌的に摘出した上記の脾臓を、 15%ゥシ胎児血清を含む DME培地 5 m£を入れたシャ ーレに入れた。 次に、 脾臓を 15 %ゥシ胎児血清を含む DM E培地約 15m£で還流して脾臓細胞 を流出させた後、 この脾臓細胞懸濁液をナイ ロ ンメ ッ シュに 通した。 この脾臓細胞を 50 ^遠心チューブに集め、 500 x g で 10分間遠心した。 こう して得たペレッ トにへモラィ ジング 溶液（155 mM NH.C^ , 10mM KHC03 , 1 raM Na2BDTA PH7. 0 ) 4 m£を加え、 懸濁させた。 0 tで 5分間放置して懸濁液中の 赤血球を破壌させた。 15%ゥ シ胎児血清 10 ^を含む DME培 地を加えてから遠心分離した。 こう して得た細胞ペレツ トを D ME培地で遠心法によって洗浄し、 生きている脾臓細胞数 を測定した。
    [0025] —方、 予め培養しておいたマウス ミ エローマ細胞 （骨髄腫 細胞） SP 2/0- Agl4(理化学研究所ジーンバンク細胞銀行） 約 2 X 107 個に上記脾臓細胞 1 X 108 個を加え、 D ME培地中 でよく混合し、 遠心分離を行なった（500x g、 10分間） 。 そ の上清を吸引し、 ペレツ トをよく解きほぐし、 40%ポリ ェチ レ ングリ コール 4000溶液 （38°Cに保温） 0.5 を滴下し、 遠 心チューブを手で 1分間穏やかに回転することによってポリ エチ レ ングリ コール溶液と細胞ペ レッ トを混合させた。 次に 38t:に保温しておいた DM E培地を 30秒毎に 1 加えて、 チ ユ ーブを穏やかに回転させた。 この操作を 10回繰返した後、 15%ゥシ胎児血清 20 ^を含む DME培地を加えて、 遠心分離 (500x g、 10分間） を行なった。 上清を除去した後、 細胞ぺ レツ トを 15%ゥシ胎児血清を含む H AT培地（DME培地にァミ ノ プテ リ ン 4 X 10— 7M、 チ ミ ジン 1.6 X 10— 5M、 ヒポキサン チン 1 X 10— 4Mになるように添加したもの） で、 遠心法によ つて 2回洗浄後、 40m£の上記 H A T培地に懸濁した。 この細 胞懸濁液を 96ゥエル細胞培養プレー トの各ゥエルに 200^ず つ分注し、 37で、 5 %炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養 を開始した。 培養中、 2〜 3 曰間隔で各ゥエルの培地を約 100 除き、 新たに上記の HAT培地 を加えることにより HA T培地中で増殖するハイプリ ドーマを選択した。 8 日目 から 15%ゥシ胎児血清を含む H AT培地（DME培地にチ ミ ジン 1.6 X 10— 5M、 ヒポキサンチン 1 X 10— 4Μになるように添加 したもの） に交換し、 ハイプリ ドーマの増殖を観察するとと もに、 10日目に、 下述の ELISA 法により、 C R F抗体産生ハ イブリ ドーマをスク リ 一ニングした。
    [0026] ( c ) ハイ プリ ドーマの榭立
    [0027] ハイ プリ ドーマ培養上清中の産生抗体の有無は ELISA 法に より測定した。 96ゥエル 用プレー ト （ImmulonlK 日本 ダイナテック株式会社） の各ゥエルに、 前述の C R P免疫原 溶液 （A280nm=0.05、 生理食塩水で希釈した） 50 ^ずつを分 注し、 25 で 2時間放置した。 次に 0.05%Tween 20—生理食 塩水で 3回洗浄した後、 各ゥエルに培養上清 50^を加え、 25 で 1時間反応させた。
    [0028] 次に、 Tween 20—生理食塩水で 200倍希釈したペルォキシ ターゼ結合抗マウス抗体 （ダコ社、 デンマーク） 5ΰμ£を各ゥ エルに加えた。 反応終了後、 0.05%Tween 20—生理食塩水で 各ゥェルを 3回洗浄し、 0. 5 mMァミ ノ ア ンチ ピ リ ン、 10mMフ エルール及び 0.005%過酸化水素水を含む溶液 を各ゥ エルに加え、 25でで 30分間反応させ、 各ゥエルの 490nmにお ける吸光度を測定した。 その結果、 192ゥエル中 4ゥエルに 抗体産生が認められた。 その 4 ゥエル中の各ハイブリ ドーマ を 24ゥエルプレ.一卜に写し、 15%ゥシ胎児血清を舍む H T培 地で 4 ~ 5 日間培養した。 その後、 再度 EUSA 法によって抗 C R P抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によりク ローニングした。 限界希釈法は、 H T培地でハイブリ ドーマ が 5個 Zm£となるように希釈した細胞浮遊液を、 予め正常 BALBXC 系マウスの腹腔細胞がゥエルあたり 2 X 104 個分注 してある 96ゥエルプレー トの各ゥエルに 100^ずつ分注した。 10日後、 ELISA 法によって抗 C R P特異的抗体を産生するハ イ ブリ ドーマのクローンをスク リ ーニングした。 その結果、 各ハイブリ ドーマにつき、 20〜40個の抗体産生ク口―ンが得 られた。 これらのクローンの中から、 増殖のよい、 抗体分泌 能の高い、 しかも安定なクローンを選び、 前述と同様の方法 で再クロー ン化を行い、 抗 C R P特異的抗体産生ハイプリ ド 一マ CRP-1, CRP-2, CRP-3 及び CRP- 4 を榭立した。 これらの ハイプリ ドーマは 1989年 4月 13日から工業技術院微生物工業 技術院に寄託されている。 寄託審号は以下のとおりである。 ハイプリ ドーマ 寄 託 蕃 号
    [0029] CRP-1 微ェ研条寄第 号（FERM -^87d)
    [0030] CRP-2 微ェ研条寄第^^号（FERM BP-> §7^) CRP-3 微ェ研条寄第 ^^号（FERM
    [0031] CRP-4 微ェ研条寄第 7号（PERM ΒΡ-^7έ) 実施例 2 ： モノ ク —ナル抗体の製造
    [0032] ( a ) イ ン ' ビ ト σ法
    [0033] マウスハイプリ ドーマ CRP- 1， CRP-2, CRP-3 及び CRP- 4 を、 それぞれ 15%ゥシ胎児血清を含む CM Ε培地中で 37 ：、 5 % 二酸化炭素雰囲気中において 72〜96時間培養した。 培養物を 遠心分離（10000 X g、 10分） 後、 上清に固形の硫酸ア ンモニ ゥムを 50%最終濃度となるように徐々に加えた。 混合物を氷 冷下で 30分間撹拌した後、 60分間放置し、 遠心分離（10000 X g、 10分） 後、 得られた沈渣を少量の lOmMリ ン酸緩衝液 （pH 8. 0 ) に溶解し、 1000倍量の 10mMリ ン酸緩衝液に対して透析 した。 これを、 lOmMリ ン酸緩衝液ですでに平衡化した DEAE— セルロ ースのカラ厶に充塡した。 モノ ク ローナル抗体の溶出 は lOmMリ ン酸緩衝液 （PH8. 0 ) と 0. 2 M NaC を含む 10mMリ ン酸緩衝液 （PH8. 0 ) の間で濃度勾配法 より行なった。 溶 出されたモノ クロ ーナル抗体を限外濾過法で濃縮し、 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （PH8. 0 ) に対して透析した。 ゥシ血清 IgG を 除くために、 透析物をやぎ抗ゥシ血清 IgG-セフ ァ ロ 一ス 4 B のカラムに通した。 次に濾過液を 0. 1 Mリ ン酸緩衝液 （PH 8. 0 ) で平衡化したプロティ ン A—セフ ァ ロ ース 4 Bのカラ ムに充填した。 カラムを ΡΗ3. 5の緩衝液で溶出して、 精製し た抗 C R Ρ特異抗体 CRP- 1(同様にして CRP-2, CRP- 3及び CRP-4) の溶液を得た。
    [0034] ( b ) イ ン ♦ ビボ法
    [0035] プリ スタ ン （ 2 , 6 , 10 , 14—テ ト ラ メ チルペンタデカ ン） 0. 5 を 10〜： 12週齢の BALBZC 系マウスの腹腔内に投与後 14 〜20日目のマウス腹腔内にィ ンビ ト 口で増殖させたハイ ブリ ドーマ CRP-1, CRP-2, CRP-3 又は CRP- 4 をマウス一匹あたり 2 X106 細胞となるように接種した。
    [0036] 各ハィブリ ドーマにつき一匹のマウスから約 10~15m£の腹 水が得られた。 その抗体濃度は、 2〜10mgZ であった。 覆 腹中のモノ クロ一ナル抗体の精製は、 上記のィ ンビトロ精製 法と同様の方法 （但し、 ャギ抗ゥシ血清 IgG-セファロース 4 Bのカ ラ ムを通す操作を除く） で行なった。
    [0037] 実施例 3 ： モノ クローナル抗体の免疫グロブリ_ンクラス
    [0038] 及び特異性の同定
    [0039] 抗 C R P特異モノ ク π—ナル抗体 CRP- 1， CRP- 2， CRP - 3 及 び CRP- 4 の免疫グロブ リ ン ' クラス及び特異性の同定はそれ ぞれォクテロニ一免疫拡散法及びヱンザィムィ ムノ アッ セィ 法により行った。 結果は表 1 に示す通りである。 表 1 モノ ク ϋ一ナル抗体 免疫グロブ リ ン . ク ラ ス
    [0040] CRP- -1 IgG,
    [0041] CRP- -2 IgG,
    [0042] CRP- -3 IgG,
    [0043] CRP- -4 IgG, 実施例 4 ： 抗体と不溶性担体 （ラテ ッ ク ス） との結合及び 反応部位の確認
    [0044] ラテッ クス溶液 （ 2 %、 Dow Chemical社 ： 粒径 0.482^n) 2 mHと、 CRP-1 抗体 2. 0 を含有する水溶液 2 とを混 合し、 約 1時間撹拌した。 遠心後 （20， 000x g、 10分間） 、 沈殿を 0. 1 % B S A溶液に懸濁し、 約 1時間撹拌した。 再び 遠心 （20， 000X g、 10分間〉 した後、 沈殿を水に懸濁し、 約 2時間撹拌した。 こ う して、 CRP - 1 抗体一ラテ ツ クス複合体 含有液を得た。 同様にして CRP- 2 抗体、 CRP- 3 抗体及び CRP- 4 抗体を用いて複合体含有液を調製した。
    [0045] それとは別に、 前述の The Journal of Immunology (vol 131， 2411- 2415)に準じて、 C R Pの A面に特異的に反応し、 B面 とは反応しないモノ ク ロ ーナル抗体 （A抗体） 及び C R Pの B面に特異的に反応し、 A面とは反応しないモノ クロ一ナル 抗体 （B抗体） を調製し、 上記操作と同様にして複合体含有 液を得た。
    [0046] これら複合体含有液 と、 20 Zm£の C R P含有液 とをスライ ドガラ ス上で混合し、 凝集像を目視的に観察した。 その結果、 A抗体及び B抗体においては凝集は認められず、 それに対して本発明の CRP- 1， 2, 3 及び 4 の各抗体において は凝集が確認された。 本発明の CRP- 1， 2, 3 及び 4抗体は、 従来の A面にのみ特異的な抗体及び B面にのみ特異的な抗体 とは、 明らかに異る形質であることがわかる。
    [0047] そこで、 C R Pの A面を対応する抗体でマスキングした CRP 20 含有液、 及び C R Pの B面を対応する抗体でマ スキングした CRP 20 Zm£含有液を調製し、 これらの液 30 ^ に、 上記の抗体複合体含有液 30 ^を加え、 スライ ドガラ ス上 で混合したところ、 本発明による CRP- 1， 2, 3 及び 4各抗体 において、 凝集が確認された。 このことは、 本発明の各抗体 の特異的反応部位が、 C R Pの A面、 及び B面とは異る部位 であること、 又、 本発明の各抗体複合体において、 C R . Pと の反応により凝集を示すことから、 本抗体は、 C R Pの側面 部位に特異的に反応していることを示唆するものである。
    [0048] 実施例 5 ： スライ ド凝集反応による定量
    [0049] 実施例 4で調製した抗体一ラテツク ス複合体含有液 30 ^と 種々な濃度の C R Pを含有する水溶液 とをスライ ドガラ ス上で混合し、 揺動して 3分後に凝集像を目視的に判定した , 結果を以下の表 2に示す。 表 2
    [0050] 1
    [0051] 体の C R P濃度
    [0052] 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0. 5 0· 25 0. 125 0. 063
    [0053] CRP- 1 + + + + + + + + + + 一
    [0054] CRP- 2 + + + + + — 一
    [0055] + + + + +
    [0056] CRP- 4 + + 十 + + + + + + — 一 一 表 2において +は凝集ありを、 そして一は凝集なしを各々意 味する。
    [0057] 実施例 6 ： 分光学的方法による測定
    [0058] 実施例 4で調製したモノ ク口ーナル抗体 CRP - 1, CRP-2, CRP- 3 及び CRP - 4 で感作したラテ ッ クス （粒径 0. 482 、 ダ ゥ社、 ドィ ッ） を用い、 自動分析機 （注 ： 一般名）（LP I A L-1 三菱化成社） によって凝集反応速度のヒ ト C R P濃度依存性 を調べた。 ヒ ト C R Pとしてはペルフ リーズ社 （ァメ リカ） から市販のものを用い、 濃度を 0. 04/» Zm£ 80/»g Z 7 ^のヒ ト C R Pを含有する 12個の水溶液を調製した。 結果を第 2図に 示す。 第 2図から明らかなように、 4種類のラテ ッ ク スの各 々は、 C R P濃度に依存した凝集反応速度 （V値 ： 単位時間 当りの透過度変化） を示した。 産業上の利用可能性
    [0059] 本発明のモノ ク ロ一ナル抗体は種々のサンプル中の C R P の量を測定するために有用である。 規則第 13規則の 2つの寄託された微生物への言及
    [0060] 寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 受託蕃号及び寄託した日付
    [0061] 1. 微ェ研条寄第 S 号 19 年 4月ほ曰
    [0062] 2. 微ェ研条寄第 S%号 1983年 4月 13曰
    [0063] 3. 微ェ研条寄第^ 号 19 年 4月ほ曰
    [0064] 4. 微ェ研条寄第 ^76号 19 年 4月 13曰
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. C反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノ ク ロー ナル抗体。
    2. 不溶性担体に固定させることにより、 C反応性蛋白質 との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできる モノ ク ロ一ナル抗体。
    3. C反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とマウス のミ ニ口一マ細胞との融合によって形成され、 C反応性蛋白 質の側面に特異的に反応するモノ ク口一ナル抗体を分泌する ことを特徴とする、 ハイプリ ドーマ細胞。
    4. C反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノ クロ一 ナル抗体を用いることを特徴とする、 血漿中の C反応性蛋白 質の免疫定量法。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    同族专利:
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    引用文献:
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    JPS62210984A|1986-03-12|1987-09-17|Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai|Separation and purification of canine c-reactive protein using hybridoma producing monoclonal antibody against canine c-reactive protein and said antibody|
    JPS62210985A|1986-03-12|1987-09-17|Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai|Separation and purification of bovine c-reactive protein using hybridoma producing monoclonal antibody against bovine c-reactive protein and said antibody|US20140163553A1|2011-05-16|2014-06-12|Covidien Lp|Thread-like knife for tissue cutting|GB2218100A|1988-03-02|1989-11-08|Erling Sundrehagen|Conjugates for the detection and/or quantification of antigenic substances in body fluids|
    JPH06236399A|1993-02-10|1994-08-23|Nec Corp|翻訳機能付きワードプロセッサ|JP5292270B2|2009-12-21|2013-09-18|富士フイルム株式会社|犬ｃｒｐ測定用乾式分析要素|
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP1103471A|JP2840852B2|1989-04-25|1989-04-25|Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体|
    JP1/103471||1989-04-25||DE1990620315| DE69020315T2|1989-04-25|1990-04-25|Monoklonaler antikörper gegen c-reaktives protein.|
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    CA 2031504| CA2031504C|1989-04-25|1990-04-25|Monoclonal antibodies to c-reactive protein|
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